一、實驗材料

無水乙醇（無錫展望），二甲苯（無錫展望），固定液（無錫菩禾），PBS（無錫菩禾），軟蠟（50-54℃），硬蠟（58-62℃），載玻片（世泰粘附性載玻片）

二、實驗儀器

HD-310型生物組織自動包埋機

HD-310型包埋機專用冷凍臺

輪轉式切片機

HD-330型攤片烤片機

三、溶液配制

1. 固定液

組織和細胞離開機體后，在一定時間內仍然延續著生命活動，會引起病理變化直至歸于死亡。為了使標本能反映它生前的正常狀態，必須盡早地用某些化學藥品迅速地殺死組織和細胞，阻抑上述變化，并將結構成分轉化為不溶性物質，防止某些結構的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會使組織適當硬化以便于隨后的處理，還會改變細胞內部的折射系數并使某些部分易于染色。

固定劑的作用對象主要是蛋白質，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作時不加考慮，如要觀察這些物質，可用特殊的方法將其固定下來。

固定劑的作用表現在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質而定，同樣一種固定液對某一材料來說是良好的，但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特征是：穿透組織的速度快。，能將細胞中的內含物凝固成不溶解物質，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細胞內含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存劑作用。

常用固定液：1、10%甲醛溶液 (甲醛：水=1：3)

2、無水乙醇

3、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）

2. PBS

10*PBS Nacl79g Kcl20g K2HPO418g KH2PO4 14.4g

定容至1L PH調至7.4

稀釋10倍可得1*PBS

3. 不同濃度乙醇

75%乙醇（無水乙醇：水=3:1）

80%乙醇（無水乙醇：水=4:1）

90%乙醇（無水乙醇：水=9:1）

95%乙醇（無水乙醇：水=19:1）

4.脫鈣液

乙二胺四乙酸（EDTA) 5.5g

1%甲醛定容至100ml

四、實驗方法

1. 取材

材料的好壞直接影響到切片的質量，無論取哪一種動植物材料，以下幾點是必須注意的。

(1) 材料選擇時須盡可能不損傷所需要的部分，動物組織取材建議灌流后取材，沖去過多血液。

(2) 取材必須新鮮，這一點對于從事細胞生物學研究尤為重要，應該盡可能割取生活著的組織塊，并隨即投入固定液。

(3) 切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細胞使其受到損傷。

(4) 切取的材料應該小而薄，便于固定劑迅速滲入內部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2（約黃豆粒大?。?。

2. 固定

組織與固定液體積比應在1:20以上，10%甲醛固定2天以上。若固定液選擇無水乙醇或Carnoy改良液，固定時間應控制在半天左右。

10%甲醛固定后的組織水洗20min*3次。若固定液選擇無水乙醇或Carnoy改良液，不得水洗

脫鈣：將骨組織按1:20浸泡于脫鈣液中，

每三天更換一次脫鈣液，共浸泡14至21天

脫鈣完成后，用針刺入骨組織若無阻礙刺穿則脫鈣完成，

若有阻力則脫鈣未完成，繼續浸泡脫鈣液，三天一次針刺觀察。

3. 脫水

生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時石蠟無法滲入組織內部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。

脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水后必須再經過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水后即可直接透蠟。

常用的脫水劑是乙醇，因為它價格便宜，易于得到。為了避免劇烈的擴散引起的組織的強烈收縮，脫水步驟應從低到高以一定的濃度梯度來進行，一般組織從50％乙醇開始，經過75%、80%、90%、95%、100%至完全脫水。脫水時間依據組織的類型和大小而定，一般各級乙醇中放置1到2h不等，如果中間須停頓，大部分材料停留在75%乙醇中，因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時間不能過長。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期保存，可加入等量的甘油。

1) 水洗后組織于5ml離心管內

2) 75%乙醇脫水1 h-2 h或過夜（此步驟可根據實驗時間安排選擇是否過夜）

3) 80%乙醇脫水1 h-2 h

4) 90%乙醇脫水1 h

5) 95%乙醇脫水0.5 h或者過夜（此步可過夜組織僅限于肝，腦，肌肉等含水量多的組織）

6) 無水乙醇脫水 20 min兩次（依據含水量多少，脫水20-60min）

7) 無水乙醇+二甲苯1:1 20min。（進行過渡，以防脫水不徹底）

4. 透明

1) 二甲苯透明20 min。

2) 二甲苯 依據透明狀況來看10min-60min。（透明時間應由組織大小而定，—般各級停留時間在30min至2h，在純二甲苯中應更換2次，總時間則以不超過3h為宜。材料經過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現透明狀態，若脫水不徹底，組織中有白色云霧狀，則重新更換無水乙醇加二甲苯1:1混合溶液。使用二甲苯透明時，應避免其揮發和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態。

5. 浸蠟

1) 軟蠟 1h

2) 軟蠟 2h

3) 硬蠟2h

6. 組織包埋

1) 包埋用的石蠟，熔點在50～60℃之間，應根據材料本身的硬度、切片的厚薄和當時的氣溫條件來選用。一般動物材料最常用的石蠟熔點為52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切片薄的用58～60℃的，切片厚的則用52～54℃的；室溫10～19℃時選用52～54℃的石蠟可順利切片，冬季可用熔點46～48℃的石蠟，夏季可選56～58℃的。

2) 包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準備好模具，將組織平放在模具底部，切面朝下后將包埋盒蓋在模具上，將熔蠟倒入模具內至蠟液溢出模具后，再輕輕提起模具，平放在冰凍臺中，待其迅速冷卻凝固約10min后取出。

包埋用蠟的溫度應略高于透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會產生結晶。以后切片時引起碎裂。

7. 切片

1) 切片方法

切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削。將所要切的包埋塊固定在標本臺上，使包埋塊外切面與標本夾截面平行，并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣后松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調節切片要求的厚度，調節時應注意指針不可在兩個刻度之間，否則容易損傷切片機，將刀臺移至近標本臺處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時就可以開始切片了。方法是：右手轉動轉輪，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度后，右手停止轉動，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放于襯有黑紙的紙盒內，注意切片速度不宜太快，搖動轉輪用力應均勻，防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻，還應注意轉動的方向，以防標本臺后移而切不到片子。切片完畢，應及時用氯仿將切片機的有關部分擦凈。

2) 切片中存在的問題及補救方法

石蠟切片是很不容易掌握的，有時很容易成功，有時則由于某種因素而造成切片的質量低劣，甚至完全失敗?，F將切片時經常遇到的一些缺點、可能的原因以及補救辦法陳列出來

切片存在問題及解決方案：

缺 點：石蠟帶彎曲不直

原 因：①石蠟塊上下兩邊不平行

②石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行

③刀口鋒利不一，局部產生差異

④蠟塊的一邊較另一邊為軟，或兩邊的硬度不一致

⑤材料未居蠟塊正中央

⑥材料大而形不正

補救辦法： ① 取下臺木，將兩邊修干

② 調節標本臺，使兩者平行

③ 移動刀片，改用新的刀口

④ 待蠟塊冷卻后再切，或重新包埋

⑤ 用刀片切去部分石蠟，使材料居中

⑥ 在大的一邊切去少許石蠟

缺 點：切片分離、不能連成帶狀

原 因：①室溫過低 ②石蠟過硬 ③材料邊緣留蠟太少 ④刀的角度不適合

補救辦法：①在切片機上方開一電燈或提高室溫

②在蠟塊面加一層45℃的軟蠟或用手指蠟摩擦塊面

③重新包埋

④矯正刀的角度

缺 點：切片卷起呈圓筒狀

原 因：①室溫過低 ②石蠟過硬 ③刀口太鈍 ④刀的傾角太大

補救辦法 ：①提高室溫

②加軟蠟

③用毛筆將蠟片攤開壓住，切2—3 片即成帶

④減小傾角

缺 點：切片粘附于切片刀，皺摺在一起

原 因：①室溫過高 ②石蠟過軟 ③刀口上留有一層石蠟 ④刀口鈍

補救辦法：①降低室溫

②將蠟塊投入涼水中稍浸耒—增加

③切片厚度，改用硬蠟包埋，用二甲苯拭去刀口的石蠟

④磨刀或移動刀口

缺 點：切片縱裂

原 因：①刀有缺口

②石蠟塊中含有顆粒、雜質

③刀口留有碎屑或細絲

④組織太硬

補救辦法：①可移動刀口

②將顆粒拽去

③清潔刀口

④讓包埋塊在水中浸泡

缺 點：切片有橫紋

原 因：①刀和臺木的固定螺絲太松 ②刀口傾斜度太大 ③刀口有石蠟屑

補救辦法：①旋緊螺旋 ②可放平后再切 ③用氯仿拭去

缺 點：切片厚薄不勻

原 因：①切片機有毛病

②夾刀不當

③未旋緊標本臺螺旋

④石蠟塊過硬

補救辦法：①矯正切片機裝置

②對癥治療

③旋緊螺旋

④將石蠟塊在水中浸泡

缺 點：每張切片厚薄不勻

原 因：①刀口震動，是由于材料過硬 ②刀的傾角太大

補救辦法：①在蠟塊表面涂一層火棉膠 ②減小傾角

缺 點：材料發生裂隙破碎或脫落

原 因：①脫水不干凈

②有透明劑殘留

③石蠟透入時，溫度過高或時間過長

④由于脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發脆

⑤材料太硬或太粗

補救辦法：①無法彌補

②增加浸蠟時間，重新包埋

③無法補救

④用正丁醇、叔丁醇和二氧六環等進行脫水和透明

⑤在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液

缺 點：切片時發生沙沙聲

原 因：①組織塊過硬 ②包埋溫度過高 ③材料內留有結晶體

補救辦法：①浸泡水中軟化 ②無法補救 ③無法補救

缺 點：石蠟塊將蠟帶抬起

原 因：①由于摩擦而產生靜電荷所致

②石蠟塊上面附有石蠟碎屑

③刀口上附有石蠟碎屑

補救辦法：①提高室溫

②用刀片將碎屑清除

③用二甲苯或氧仿清除

8. 展片

首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，這時切片都浮在水面上，由于表面張力的作用使切片自然展平，將粘附性載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置。50℃拷片30min以上

9. 脫蠟及復水

二甲苯 20min

二甲苯 20min

100% 乙醇 20min

90% 乙醇 2-3min

80% 乙醇 2-3min

70% 乙醇 2-3min

五、病理切片實驗室的清潔和儀器使用管理

按照抽屜標明擺放物品，毛刷、鑷子等需要定期檢查更換。

六、儀器和耗材的維護

儀器使用做好登記

常規耗材包括：刀片，軟蠟，硬蠟，載玻片，無水乙醇，二甲苯，甲醛

不常用耗材：鑷子、毛刷